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Genetische Analysen

 

Genetische Identifizierung von Obstsorten

 
 
Wie kann man eine Sorte identifizieren?
 
Phänologische Merkmale werden traditionell zur Sortenidentifizierung verwendet. Solche phänologischen Merkmale sind z. B. Tiefe von Stiel- und Kelchgrube, Kelchblätter, Kernhaus, Samen, Samenfach, Leitbündel, Fruchtschale, Fruchtfleisch, Wachstum, Blattform, Rindenfarbe u.s.w. Da zahlreiche phänologische Merkmale jedoch je nach Standort, Unterlage, Pflegemaßnahmen und Witterung großen Schwankungsbreiten unterliegen, wird eine zuverlässige Bestimmung erheblich erschwert.
Seit April 2004 ist das Kompetenzzentrum Obstbau-Bodensee (KOB) an einem internationalen Projekt im Rahmen von INTERREG IIIA Bodensee-Alpenrhein-Hochrhein zur Erhaltung alter Kernobstsorten im Projektgebiet beteiligt, wobei vom KOB die phänologische Identifizierung der Sorten durch genetisches Fingerprinting unterstützt wird.
 
Was versteht man unter genetischem Fingerprinting?
 
 Genetisches Fingerprinting (Fingerabdruck) ist ein Verfahren, mit dem durch das Auffinden bekannter DNA-Abschnitte (Marker, Genort) die jeweiligen getesteten Organismen, beispielsweise Apfel, Kirsche, Pflaumen, Birne etc. identifiziert werden können. Dazu werden DNA-Fragmente miteinander verglichen, die charakteristisch für die einzelne Obstsorte sind. Beispielhaft ist hierzu die Situation bei Apfel dargestellt (siehe Abb. 1).
 
Im Vergleich zur phänologischen Identifizierung von Obstsorten, ist die genetische Identifizierung genauer, aussagekräftiger und kann unabhängig von den Jahreszeiten durchgeführt werden. Zur Untersuchung benötigt man sehr wenig Material. Durch Erstellung einer Datenbank von bereits identifizierten Sorten können unbekannte Sorten identifiziert werden.
 

Wie führt man die Untersuchung aus?

 
Das zur Sortenidentifizierung benötigte Material kann aus gesunden jungen, frischen Blättern, erwachsenen Blättern, Früchten, einjährigen Trieben, Knospen, Rinde, Wurzeln oder sogar Kompott bestehen, das heißt aus allen Pflanzenteilen eines Baumes außer Samen und abgeblühten Blüten. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist die DNA-Extraktion aus Cocktail-Früchten oder aus Saft noch in der Testphase. Das Probenmaterial wird sofort verarbeitet oder gefriergetrocknet und in einer Tiefkühltruhe bei –32°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Die Gewinnung der DNA erfolgt nach international standardisierten und reproduzierbaren Methoden.  
 
Zur Charakterisierung der Obstsorten werden Genmarker aus der internationalen Genbank ausgewählt. Ein Marker ist ein kurzes DNA-Stück, das für den Nachweis von bestimmten DNA-Abschnitten mit der PCR-Methode (Vervielfältigung eines Gens) erforderlich ist. Er besteht meist aus 18-24 Nuklotiden. Bei dem PCR-Nachweis heftet sich der Marker an die nachzuweisende DNA-Sequenz und startet einen Kopiervorgang. Die zu suchende DNA-Sequenz wird anschließend so oft vervielfältigt bis eine analytisch messbare Menge vorhanden ist. Danach werden die PCR-Produkte zur Fragmentanalyse auf einen 8-Kapillarsequenzierer aufgetragen. Die Messergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Daraus kann eine Cluster-Analyse durchgeführt und anschließend ein Verwandtschaftsdendrogramm erstellt werden.
 
 
 

Einige Beispiele zu den Ergebnissen:

 
- Ergebnisse der Mutanten bei ‚Braeburn’ und ‚Fuji’
In Tab. 1 sind die Fingerprints von 6 ‚Braeburn’ Mutanten und 2 ‚Fuji’ Mutanten dargestellt, die auf 12 Loki mit 12 Genmarkern getestet wurden. Die Zahlen in Tab. 1 zeigen die Länge des Fragmentes in Basenpaaren (Einheit der Erbsubstanz). ‚Braeburn’ und ‚Fuji’ sind diploid, deshalb ergeben sich für jeden Lokus maximal zwei Zahlen. Eine Zahl (z. B. 218bp bei Loci 6 von Fuji Kiku 8) bedeutet, dieser Lokus ist homozygot, zwei Zahlen (z.B. 108bp und 164bp bei loci 1 von ‚Braeburn Lochbuie’) bedeuten, dieser Lokus ist heterozygot. Wie in Tab. 1 dargestellt, sind die Fragmente zwischen Mutanten gleich. Es zeigt sich, dass die Methode noch nicht für die Identifizierung von Mutationen geeignet ist, da die Genorte, in denen sich die Mutanten einer Sorte unterscheiden, noch nicht gefunden sind. Nach erfolgreicher Suche könnte dann die Entwicklung eines sorteneigenen Primers für Mutanten erfolgen.
 
 
- Sortenvergleich bei Süßkirschen
Bei Süßkirschen ist die Entwicklung der Technik noch am Anfang. In Tab. 2 sind beispielhaft Ergebnisse von 33 Proben aus Weinsberg, Bavendorf und der Landesanstalt für Pflanzenschutz Baden-Württemberg dargestellt. Die Süßkirsche ist diploid wie die meisten Äpfel. Deshalb zeigen sich bei jedem getesteten Lokus in der Regel höchsten zwei Zahlen. Im Ergebnis waren zwei ‚Noire de Meched’ (W49, W46) von Weinsberg identisch.   L47, W48, W54 und W103 wurden als ‚Vanda echt’ bezeichnet, die andere wie L48, W51, W50 W100, W101 und W102 sind falsch und als unbekannte Sorten gekennzeichnet.
Die Sorten ‚Sweetheart’ und ‚Sumste’ von drei Herkünften sind identisch. ‚Karina’ (BVK7) in Bavendorf ist nicht identisch mit ‚Karina’ 61510 (W52, echt) aus Weinsberg, aber identisch mit ‚Oktavia’ (BVK1) in Bavendorf. ‚Skeena’/Gi5 (BVK11) ist nicht identisch mit W109, W110, und BVK5. ‚Giorgia’ aus der Landesanstalt und aus Weinsberg sind nicht identisch; weitere Nachprüfung der Proben und der Methodik ist aber erforderlich.
 
Fazit
 
Mit genetischer Identifizierung von Sorten können durch DNA-Fingerprints zwei unbekannte Sorten verglichen werden. Des weiteren sind durch DNA-Fingerprints bereits identifizierte Sorten mit den Fingerprints unbekannter Proben vergleichbar, falls die Sorten in der Datenbank bereits hinterlegt sind. Die Methode wird am KOB bei Apfel, Birne, Süßkirsche und Sauerkirsche bereits routinemäßig durchgeführt und ist für Zwetschgen und Quitten in der Erprobung.

 

Im Auftrag von verschiedener Lebensmittelhandelsunternehmen, Discountern und Qualitäts-Kontrolldiensten in Deutschland wurden schon zahlreiche Sorten identifiziert. Durch Erweiterung der Genbank mit weiteren, neueren Sorten wird zukünftig eine sichere Sortenerkennung für Züchtung, Baumschulen und Qualitätskontrolle möglich sein und als Dienstleistung ‚gerichtsfeste Sortenidentifizierung’ der Praxis zur Verfügung stehen.